Test in vitro du revêtement de sel des tissus en tant qu'agent antiviral potentiel dans les masques faciaux réutilisables

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 17041 (2022) Citer cet article

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Pendant la pandémie de maladie à coronavirus (COVID-19), le port de masques faciaux dans les espaces publics est devenu obligatoire dans la plupart des pays. Le risque d'auto-contamination lors de la manipulation des masques faciaux, qui était l'une des premières préoccupations, peut être atténué en ajoutant des revêtements antiviraux aux masques. Dans la présente étude, nous avons évalué l'efficacité antivirale du chlorure de sodium déposé sur un tissu adapté à la fabrication de masques en tissu réutilisables à l'aide de techniques adaptées à l'environnement domestique. Nous avons testé huit conditions de revêtement, impliquant à la fois des méthodes de pulvérisation et d'immersion et trois dilutions de sel. Les particules du virus de la grippe A H3N2 ont été incubées directement sur les matériaux recouverts de sel, collectées et ajoutées aux cultures épithéliales des voies respiratoires humaines en 3D. La réplication du virus vivant dans l'épithélium a été quantifiée au fil du temps dans les lavages apicaux collectés. Par rapport au matériau non enrobé, les dépôts de sel à ou au-dessus de 4,3 mg/cm2 ont nettement réduit la réplication virale. Cependant, même pour de plus grandes quantités de sel, l'efficacité du revêtement restait dépendante de la taille et de la distribution des cristaux, qui à leur tour dépendaient de la technique de revêtement. Ces résultats confirment la pertinence du revêtement de sel comme protection antivirale sur les masques en tissu, mais soulignent également qu'une attention particulière doit être portée au protocole de revêtement lors du développement de solutions grand public.

En réponse à la pandémie de maladie à coronavirus (COVID-19) et suite aux recommandations de l'Organisation mondiale de la santé1, la plupart des pays ont élaboré des stratégies et des lignes directrices pour contrôler la transmission du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) dans la population générale. En plus de la distanciation sociale, les directives encouragent ou imposent l'utilisation de masques faciaux (jetables ou réutilisables) dans les lieux publics2. Cela a conduit à une utilisation généralisée des masques faciaux par la population générale pour freiner la transmission des maladies respiratoires. L'utilisation de masques en tissu non médicaux et réutilisables3, qu'ils soient faits maison ou produits commercialement, était une solution acceptée à la pénurie initiale de masques jetables4 et a été immédiatement reconnue comme un potentiel pour accroître la durabilité des directives de santé publique qui ont été établies. La protection qu'offrent les masques réutilisables contre la transmission des virus dépend de leurs performances de filtration pour les particules de 1 à 3 μm de diamètre5,6, qui varient considérablement selon le matériau utilisé pour les fabriquer7,8,9,10,11. Au-dessus de 3 μm, l'efficacité de filtration est généralement de 100 % pour la plupart des textiles courants10, ce qui permet de bloquer efficacement toutes les particules d'un diamètre > 3 μm qui pourraient entrer en contact avec le masque. Étant donné que les particules de cette taille peuvent transporter d'importantes charges virales12, le revêtement de la surface du masque avec un agent antiviral peut réduire la transmission des fomites.

Au cours des premières étapes de la pandémie de COVID-19, les inquiétudes concernant le risque d'auto-contamination1 ont alimenté un débat sur la question de savoir si la population générale non formée devrait porter des masques faciaux en raison de la crainte que l'auto-contamination annule les avantages de leur utilisation13. Dans ce contexte, la communauté scientifique a fortement préconisé le port du masque14,15, ce qui s'est appuyé sur des études16,17 et des modèles mathématiques18,19. Ainsi, le revêtement de la surface du masque avec des agents antiviraux peut aider à réduire la transmission indirecte des virus respiratoires20,21,22. Les métaux et les oxydes métalliques, les polymères antimicrobiens, les matériaux photoréactifs ou dérivés du carbone et les biomolécules ont été considérés comme des revêtements de masques antiviraux23,24,25,26,27 et ont été largement examinés13,28,29. Quan et al.20 ont décrit une méthode simple pour recouvrir les masques chirurgicaux fabriqués à partir de polypropylène non tissé (soufflé à l'état fondu) avec du chlorure de sodium (NaCl). Ils ont rapporté que les particules virales de la grippe H1N1 étaient inactivées par une perturbation physique de leur capside dans les 5 minutes en raison de la dissolution locale et de la recristallisation du sel enrobé lorsqu'elles étaient mouillées par des aérosols chargés de virus20,30. Ce revêtement était stable et conservait son efficacité même après un stockage dans des conditions difficiles20. Les auteurs ont ensuite démontré que les revêtements de sel fonctionnalisent les membranes inertes pour la capture et l'inactivation efficaces des agents pathogènes en suspension dans l'air31. Pour une utilisation dans les revêtements antiviraux, le NaCl est sûr, peu coûteux, facile à obtenir et pourrait être utilisé dans des environnements non professionnels pour la production de masques faciaux réutilisables faits maison et commerciaux.

L'objectif du présent travail était d'évaluer plus avant la formule de la solution saline rapportée par Quan et al.20 pour le revêtement des masques faciaux réutilisables fabriqués à partir de tissus courants. Comme les masques en tissu sont lavés régulièrement pour être réutilisés, les utilisateurs devront renouveler le revêtement de sel antiviral après chaque lavage. Par conséquent, nous avons recherché si les méthodes de dépôt de sel adaptées à un usage domestique, c'est-à-dire la pulvérisation et le trempage, et les tissus courants recommandés pour la fabrication de masques faciaux réutilisables10 affecteraient les propriétés antivirales de la couche de sel déposée.

Nous avons sélectionné un chiffon de nettoyage domestique universel comme tissu d'essai et l'avons enduit de concentrations incrémentielles de sel via une application contrôlée automatisée par pulvérisation ou par trempage. La quantité de sel déposée, ainsi que la taille et la distribution des cristaux ont été évaluées pour caractériser les conditions de revêtement avant l'exposition au virus. Les propriétés antivirales des revêtements ont été testées et comparées par des essais biologiques in vitro utilisant le virus de la grippe A H3N2 (A/H3N2, famille Orthomyxoviridae, genre Alfainfluenzavirus, espèce Influenza A virus, sérotype H3N2) cultivé dans un modèle de culture de tissu épithélial pulmonaire tridimensionnel (3D).

Cinq conditions de pulvérisation et trois conditions de revêtement par immersion ont été définies. Le dépôt par pulvérisation avec la formulation de sel contenant du Tween-20 comme agent mouillant20 a été effectué, un morceau de tissu par condition, à l'aide d'un dispositif de pulvérisation dont l'ouverture de la valve a été modifiée en fonction des unités de course arbitraires 1, 3, 5 et 10, étiquetées Spr S1, Spr S3, Spr S5 et Spr S10, respectivement. La formulation de pulvérisation a été diluée cinq fois pour un échantillon supplémentaire avec l'unité de course 3 (Spr S3 Dil5 ×). Le revêtement par trempage a été effectué sur trois morceaux de matériau par condition avec la formulation de sel non dilué (Dip No Dil), quintuple (Dip Dil5 ×) et décuplée (Dip Dil10 ×). La quantité de sel déposée sur le tissu (mg/cm2), la distribution et la taille des cristaux de sel ont été mesurées pour caractériser chaque condition de revêtement, avant exposition aux particules virales.

Les méthodes de revêtement par pulvérisation et par trempage ont donné une augmentation linéaire du sel déposé sur les tissus par rapport à l'unité de course appliquée ou à la dilution de la concentration en sel de la solution de trempage (Fig. 1).

Concentrations de sel (chlorure de sodium, NaCl) déposés sur les tissus enduits par pulvérisation et par immersion. Pour les traitements Spr, un seul morceau de matériau (42,25 cm2) a été préparé et trois morceaux (répliques de 1 cm2) en ont été découpés. Pour les traitements Dip, trois échantillons (7,5 cm2) ont été préparés séparément. (a) Revêtement par pulvérisation avec les unités de trait 1, 3, 5 et 10. Équation de la droite de régression : Y = 2,0805x - 2,076 ; R2 = 0,9774 ; R = 0,9886 ; P < 0,05. (b) Revêtement par trempage avec une solution saline diluée 10 × , 5 × ou aucune dilution. Les données sont des moyennes ± écarts-types. Équation de la droite de régression : Y = 45,256x + 0,3492 ; R2 = 0,9968 ; R = 0,9984 ; P < 0,0001. Les concentrations de sel pesées sont affichées et exprimées en milligrammes par centimètre carré.

Des micrographies électroniques à balayage du matériau d'essai (Fig. 2) montrent qu'après le dépôt et l'évaporation, les méthodes de revêtement par pulvérisation et par immersion ont produit une dispersion distribuée de cristaux le long des fibres du tissu.

Images au microscope électronique à balayage du matériau d'essai, recouvert de sel par des méthodes de pulvérisation et d'immersion. La formulation de sel a été utilisée non diluée ou diluée. Les traitements par pulvérisation ont permis le dépôt de quantités croissantes de sel en faisant varier l'ouverture de la valve du dispositif de pulvérisation selon des unités de course arbitraires. (a) Sans revêtement, (b) Spray, formulation de sel non dilué, unité de course 1 (Spr S1), (c) Spray, formulation de sel dilué au quintuple, unité de course 3 (Spr S3 Dil5 ×), (d) Spray, formulation de sel non dilué, unité de course 3 (Spr S3), (e) Spray, formulation de sel non dilué, unité de course 5 (Spr S5), (f) Spray, formulation de sel non dilué, unité de course 10 (Spr S10 ). Pour les traitements par trempage, les matériaux d'essai ont été immergés dans des formulations de sel (g) diluées dix fois (Dip Dil10 ×), (h) diluées cinq fois (Dip Dil5 ×) et (i) non diluées (Dip No Dil). Les flèches sur les images pointent vers des exemples de cristaux de sel et d'agrégats trouvés sur les matériaux d'essai.

La taille des cristaux a été déterminée par le débit de pulvérisation dans le procédé de revêtement par pulvérisation et par le taux de dilution de la solution de trempage dans le procédé de revêtement par trempage. Avec la méthode de revêtement par pulvérisation, les faibles débits ont donné de petits cristaux monodispersés, tandis qu'à des débits plus élevés, des cristaux plus gros et plus polydispersés se sont formés après le séchage du liquide coalescé déposé sur la surface du tissu.

L'échantillon non revêtu (Fig. 2a) et les échantillons avec les volumes déposés les plus faibles, Spr S1 (Fig. 2b) et Spr S3 Dil5 × (pulvérisés avec un volume plus élevé, mais une concentration en sel plus faible ; Fig. 2c), avaient un aspect similaire. Très peu de cristaux de sel ont été observés dispersés sur les fibres des échantillons Spr S1 et Spr S3 Dil5 ×. Cependant, bien qu'ils ne soient pas visibles par microscopie électronique à balayage (MEB), des cristaux de sel étaient présents sur les fibres des échantillons Spr S1 et Spr S3 Dil5 ×, comme l'a confirmé la spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDX) (Fig. S1a et b supplémentaires, respectivement). Pour les volumes de pulvérisation moyens, Spr S3 et Spr S5, les cristaux de sel étaient plus clairement visibles sur les micrographies électroniques à balayage ; ils formaient de petits agrégats le long des fibres, plus distinctement dans les échantillons Spr S3 que dans les échantillons Spr S5 (Fig. 2d, e, respectivement). Au volume de pulvérisation le plus élevé, c'est-à-dire les échantillons Spr S10 (Fig. 2f), de gros cristaux enveloppant plusieurs fibres se sont formés. Dans les échantillons Spr S3, Spr S5 et Spr S10, en plus des gros cristaux observés par SEM, de petits cristaux de sel étaient répartis le long des fibres dans tout le matériau, comme l'a révélé l'EDX (Fig. S1c – e supplémentaire).

Dans la méthode de revêtement par trempage, les solutions diluées (Dip Dil10 × et Dip Dil5 ×) et non diluées (Dip No Dil) (Fig. 2g – i, respectivement) ont conduit à la formation de cristaux de sel recouvrant les fibres. Comme dans les échantillons d'essai pulvérisés, la taille moyenne des cristaux sur les fibres revêtues par trempage variait avec la concentration en sel dans la solution. L'échantillon Dip Dil10 × montrait des cristaux de sel de taille moyenne (Fig. 2g), tandis que l'échantillon Dip No Dil était caractérisé par de très gros cristaux de sel qui recouvraient complètement les fibres (Fig. 2i). Les matériaux d'essai fortement enrobés de sel, c'est-à-dire les échantillons Spr S10 et Dip No Dil, sont devenus très rigides pendant la manipulation. Un tel raidissement n'a pas été observé à des concentrations de sel inférieures.

Après contact direct avec les échantillons revêtus, des particules virales ont été collectées et utilisées pour inoculer des inserts de culture de cellules épithéliales des voies respiratoires humaines MUCILAIR. Le même protocole a été exécuté avec des échantillons de tissu recouverts par pulvérisation d'une solution à 1 % de Tween-20/eau avec les traits 3, 5 et 10 (Tween Str3, Tween Str5 et Tween Str10). L'intégrité épithéliale au cours de l'infection virale a été surveillée en mesurant la résistance transépithéliale (TEER) en comparaison avec des cultures non infectées non traitées (Mock) et des cultures directement infectées (no-mask). La TEER est une mesure dynamique et non invasive qui reflète l'intégrité de l'épithélium et varie généralement de 200 à 600 Ω·cm2 dans des cultures MUCILAIR non endommagées32. La perturbation des jonctions cellulaires et la présence de trous dans l'épithélium entraînent des valeurs TEER inférieures à 100 Ω·cm2.

Vingt-quatre heures après l'infection virale, tous les épithéliums MUCILAIR présentaient des valeurs de TEER comparables à celles du témoin fictif (Fig. 3). À 72 h après l'infection (hpi), les valeurs de TEER ont diminué à moins de 100 Ω·cm2 dans la condition de contrôle sans masque indiquant une perturbation grave de la structure épithéliale due à une réplication virale intense. En moyenne, toutes les cultures inoculées avec le virus collecté après incubation avec les matériaux de test traités ont conservé des valeurs TEER comparables à celles du contrôle fictif. Cependant, dans les conditions de test avec les plus faibles concentrations de sel (Spr S1 et Spr S3Dil5 ×) et de Tween-20 (Tween Str3 et Tween Str5), une culture répétée dans chaque groupe de traitement avait une valeur TEER inférieure à 100 Ω·cm2. En revanche, dans les conditions de test avec des concentrations plus élevées de sel et de Tween-20, toutes les cultures répétées avaient des valeurs TEER similaires à celles du contrôle fictif. À 144 hpi, l'intégrité des tissus était gravement affectée par l'infection virale dans toutes les cultures, quelles que soient les conditions de test.

Mesures de la résistance électrique transépithéliale (TEER) dans les épithéliums MUCILAIR à 24, 72 et 144 h après l'infection. Les moyennes ± les erreurs standard sont indiquées ; n = 3 dans tous les traitements, sauf pour les échantillons non revêtus (n = 5). La ligne pointillée représente la limite de 100 Ω·cm2 d'intégrité tissulaire. Culture témoin non-infectée et non-traitée factice ; Détergent Triton X-100 utilisé comme contrôle positif.

Une analyse comparative de la réplication du virus dans les cellules n'a pu être effectuée que 24 et 72 h après l'infection ; les copies du génome viral n'étaient détectables dans aucun des échantillons avant 24 h. Au-delà de 72 hpi, la réplication virale dans les cellules a nettement diminué dans la condition témoin sans masque et atteint un plateau dans l'échantillon non revêtu, biaisant la comparaison entre les traitements (données non présentées), comme cela a été précédemment rencontré avec ce système épithélial32.

À 24 hpi, des copies du génome viral ont pu être détectées et quantifiées dans les lavages apicaux cellulaires collectés à partir du contrôle sans masque et des échantillons traités avec le sel le plus faible (Spr S1, Spr S3Dil5 × et Spr S3) et les concentrations de Tween-20 (Tween Str3 et Tween Str5), mais pas des autres échantillons (Fig. 4a, c).

TAQMAN reverse transcription-polymerase chain reaction pour la détermination du nombre de copies du génome (gc) du virus A/H3N2 dans le milieu apical des épithéliums MUCILAIR infectés après contact direct du virus avec un matériel de test non enrobé ou un matériel de test enrobé de diverses concentrations de sel ou de Tween. (a) Revêtements de sel, log10 A/H3N2 nombre de gc/mL quantifié à 24 et 72 h après l'infection. ( b ) Revêtements de sel, réplication virale 72 h après l'infection. (c) Revêtements Tween, log10 A/H3N2 gc number/mL quantifié à 24 et 72 h après l'infection. ( d ) Revêtements d'interpolation, réplication virale 72 h après l'infection. Les données sont exprimées en pourcentage par rapport à la moyenne du log10 du nombre de gc/mL du virus A/H3N2 quantifié dans le groupe de traitement infecté non enrobé, qui a été normalisé à 100 %. Les moyennes ± les erreurs standard sont indiquées ; n = 3 dans tous les traitements, sauf pour les non revêtus (n = 5). *P < 0,05.

Soixante-douze heures après l'infection, le virus a été détecté dans les lavages apicaux de tous les groupes de traitement de revêtement. Cependant, tous les traitements, y compris l'absence de revêtement (non revêtu), ont affecté la réplication virale, comme en témoigne une diminution du nombre de copies du génome viral dans les lavages apicaux de culture cellulaire par rapport à celui de la culture témoin infectée (contrôle sans masque, Fig. 4b). Par rapport à la condition non revêtue, le revêtement de sel sous les traitements Spr S3, Spr S10, Dip No Dil et Dip Dil10 × a exercé un effet antiviral supplémentaire et marqué, significatif pour Spr S3 (P = 0,0269) et Dip No Dil (P = 0,0454). Les nombres les plus faibles de copies du génome A/H3N2 ont été obtenus dans les lavages apicaux collectés à partir des cultures Spr S3 et Dip No Dil, qui présentaient des réductions log10 de 4,31 et 3,95, respectivement, du nombre de copies du génome par rapport à celles des cultures de traitement infectées et non revêtues. Bien que non statistiquement significative, la diminution de la réplication virale sous les traitements Spr S10, Dip Dil 5 × et Dip Dil était toujours remarquable, avec des réductions log10 de 3,5, 2,99 et 3,65, respectivement. Nous n'avons observé aucune corrélation claire entre la concentration en sel dans le revêtement et les niveaux de copie du génome viral, car les meilleurs résultats ont été obtenus avec les échantillons Spr S3 et Dip No Dil, avec des concentrations en sel de 4,73 et 45,54 mg/cm2, respectivement. Une activité antivirale pertinente semblait être atteinte au-dessus d'un certain seuil de dépôts de sel à la surface du matériau. Le traitement Spr S5 était la seule exception à cette observation, qui aurait pu entraîner une réduction plus importante du nombre de copies du génome. Néanmoins, deux des trois répliques ont présenté des réductions log10 marquées de 3,74 et 3,54 du nombre de copies du génome, alors qu'une seule réplique n'a pas montré d'effet sur la réplication virale.

Dans les conditions de test Tween-20 (Fig. 4c, d), seule la concentration la plus élevée de Tween-20, c'est-à-dire le traitement Tween Str10, a nettement affecté la réplication virale, avec une réduction log10 de 3,57 du nombre de copies du génome par rapport à celles des échantillons de test non revêtus.

Étant donné que la quantification de la copie du génome viral dans les lavages apicaux des cellules peut ne pas être un indicateur complet du potentiel d'infectivité des particules virales, nous avons déterminé la dose d'infectivité tissulaire à 50 % (TCID50) pour des conditions de test sélectionnées (Fig. 5) en effectuant des titrages de virus à base de cellules dans des cellules rénales canines de Madin-Darby transfectées avec de l'ADNc codant pour l'α-2,6-sialyltransférase humaine (MDCK-SIAT1).

Titres en virus A/H3N2 dans le milieu apical des épithéliums MUCILAIR infectés après contact direct du virus avec un matériel de test non enrobé ou enrobé de diverses concentrations de sel, déterminés à 72 h post infection. Les données sont exprimées en pourcentage par rapport à la moyenne de log10 TCID50/mL dans le groupe de traitement infecté non enrobé, qui a été normalisée à 100 %. Les moyennes ± les erreurs standard sont indiquées ; n = 3. **P < 0,01 ; ***P < 0,001.

Comme observé précédemment pour le nombre de copies du génome, les titres de virus étaient significativement plus faibles dans les conditions de test Spr S3 (P = 0,000752), ainsi que dans les conditions Spr S10 (P = 0,00318) et Dip Dil 10 × (P = 0,000856), que dans la condition de test non revêtu. Les résultats du test TCID50 étaient conformes à ceux obtenus par amplification en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (RT-qPCR), qui indiquaient une diminution marquée du nombre de particules virales capables de survivre et de se répliquer après 10 minutes de contact direct avec les tissus enduits de sel.

Pour collecter les particules virales, le matériel de test inoculé a été incubé pendant 5 minutes dans du milieu cellulaire. Bien que la solution contenant le virus ait été diluée au 1/10 avec du milieu cellulaire avant l'infection cellulaire, la teneur en sel était toujours supérieure à l'isotonicité dans la plupart des échantillons de cellules (tableau supplémentaire S1) et peut avoir affecté la pénétration du virus dans les cellules. Pour vérifier que la désactivation du virus était uniquement due au contact direct des particules virales avec les tissus enduits de sel, et n'ayant pas eu lieu pendant l'étape de collecte ou la phase d'inoculation de l'épithélium MUCILAIR, nous avons incubé des particules de virus A/H3N2 dans des solutions salines à 0,9 %, 3,5 % et 35 %. L'infectiosité virale n'a pas été affectée par le traitement et les copies du génome viral ont pu être quantifiées dès 24 hpi (Fig. 6a), dans toutes les conditions de test.

Effet de la pré-incubation du virus dans des solutions salines hypertoniques sur la réplication virale dans les cellules. (a) TAQMAN transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase pour la détermination des copies du génome du virus A/H3N2 (gc) dans le milieu apical des épithéliums MUCILAIR infectés après incubation du virus dans des solutions salines de différentes concentrations. Les données sont exprimées en nombre log10 A/H3N2 gc/mL, quantifié à 24 et 72 h après l'infection. Les moyennes ± les erreurs standard sont indiquées ; n = 3. ( b ) Mesures de la résistance électrique transépithéliale (TEER) dans les épithéliums MUCILAIR 24, 72 et 144 h après l'infection. Les moyennes ± les erreurs standard sont indiquées ; n = 3. La ligne pointillée représente la limite de 100 Ω·cm2 d'intégrité tissulaire. Culture témoin non-infectée et non-traitée factice ; Triton X-100, détergent utilisé comme contrôle positif.

À 72 hpi, le nombre de copies du génome a augmenté d'un facteur log10 de 2 à 3 dans les trois conditions de test salin, similaire à celui du milieu de contrôle. Les résultats de la TEER ont confirmé que les traitements salins étaient inefficaces pour contrôler l'infection virale. Comme dans le milieu témoin, les valeurs de TEER ont chuté en dessous de 100 Ω·cm2 dès 72 hpi dans les trois groupes de test salin (Fig. 6b). Dans tous les échantillons, l'intégrité épithéliale a été rapidement perturbée en raison d'une réplication virale étendue, même après incubation du virus dans une solution saline saturée (solution saline à 35 %) pendant 10 min.

La présente étude a étendu les découvertes de Quan et al.20 sur un matériau qui a de bonnes propriétés de filtration des particules, qui peut être lavé et intégré dans des masques faciaux réutilisables10. De plus, nous avons utilisé des techniques d'enrobage au sel applicables dans un cadre domestique. Enfin, nous avons vérifié la propriété antivirale du revêtement de sel avec un cadre de laboratoire simple, dans des épithéliums des voies respiratoires 3D humains non modifiés33,34. Ce modèle de test pourrait être applicable à d'autres types de revêtement antiviral sur divers matériaux.

Les deux méthodes de dépôt de sel, pulvérisation et trempage, ont conduit à la formation de cristaux sur les surfaces du tissu, la taille des cristaux de sel dépendant de la dilution et du volume. À l'exception des conditions de revêtement à plus faible concentration, Spr S1 et Spr S3 Dil5 × , qui étaient inefficaces bien que le sel soit bien réparti sur les échantillons de tissu, toutes les autres conditions de test ont entraîné un effet clair des dépôts de sel sur l'activité virale. Dans ces échantillons, le nombre de copies du génome viral était très faible ou non détectable 24 hpi. La réplication virale était encore réduite de 3 à 4 log10 72 hpi dans cinq conditions de test, c'est-à-dire Spr S3, Spr S10, Dip No Dil, Dip Dil5 × et Dip Dil10 × . Ces résultats ont été confirmés par les résultats du test TCID50 montrant que moins de particules virales étaient capables d'infecter les cellules après avoir été en contact direct avec les tissus enduits de sel. Ces résultats sont conformes à ceux d'études antérieures qui ont démontré les effets du dépôt de sel sur le filtre interne des masques chirurgicaux suivi de l'inoculation du virus de la grippe A/H1N120, et de la pulvérisation de sel sur la couche externe des masques chirurgicaux et de l'inoculation ultérieure d'un virus porcin (virus de la gastro-entérite transmissible)35. Cependant, il n'y avait pas de corrélation négative claire entre les concentrations de sel sur les tissus et le nombre de copies du génome viral dans les cultures cellulaires. La plus forte réduction des particules virales a été observée pour deux concentrations de revêtement de sel très différentes, Spr S3 (4,73 mg/cm2) et Dip No Dil (45,54 mg/cm2). Les autres conditions de revêtement dans cette gamme ont supprimé la réplication virale à des niveaux inférieurs, mais ont tout de même diminué la charge virale d'un facteur log10 de 3. En revanche, les traitements Spr S1 (0,58 mg/cm2) et Spr S3 Dil5 × (0,41 mg/cm2) étaient clairement insuffisants pour contrôler la réplication virale, et nous suggérons qu'une concentration seuil de sel est nécessaire pour inhiber la réplication virale. Il convient de noter ici que les quantités efficaces de sel déposé signalées par Quan et al.20 se situaient entre 6,16 mg/cm2 et 24, 64 mg/cm2, ce qui se situe bien dans la fourchette des quantités de sel déposées sur nos échantillons actifs.

L'effet antiviral d'un enrobage de sel semble être une conséquence de la perturbation de la capside virale due à la dissolution locale du sel suivie d'une recristallisation20,30. Cet effet peut varier non seulement avec la quantité de sel dans le revêtement, mais également avec la distribution et la taille des cristaux de sel sur les tissus, qui à leur tour dépendent de divers paramètres et techniques de dépôt de sel. Cela peut expliquer la faible corrélation négative observée dans cette étude entre la concentration en sel sur les tissus et la désactivation virale au-delà d'un certain seuil de concentration en sel.

Parallèlement à l'hypothèse de dissolution/recristallisation du sel, nous avons envisagé la possibilité que les résidus de sel dissous lors de l'étape de collecte du virus aient également contribué à la désactivation virale en raison de l'hypertonicité du milieu, comme précédemment montré pour les micro-organismes aéroportés35. Pour tester cette hypothèse, des particules de virus A/H3N2 ont été incubées directement dans des solutions de concentrations salines variables, de l'isotonicité à la saturation, avant leur inoculation dans les cultures cellulaires MUCILAIR. Les résultats ont révélé que les solutions salines n'avaient aucun effet sur la réplication virale au fil du temps et ne contribuaient pas au maintien de l'intégrité des cellules épithéliales (TEER) par rapport à celle du milieu témoin. Dans les expériences de revêtement de tissu, les concentrations de sel dans l'étape de collecte de virus se situaient clairement dans la plage des solutions salines testées (0,95 à 5,46 % pour le revêtement contre 0,90 à 17,9 % pour les solutions salines ; tableau supplémentaire S1). De même, dans un système de test impliquant le SRAS-CoV-2, la pré-incubation du virus avec des solutions salines jusqu'à 1,7 % n'a pas modifié la réplication virale dans les cellules Vero36, et l'incubation du virus A/H3N2 dans une solution de NaCl 1 M (5,8 %) jusqu'à 1 h n'a pas diminué les titres d'hémagglutinine et les unités formant plaque dans les cellules MDCK-SIAT1 par rapport à un contrôle salin tamponné au phosphate37. Ces résultats ont confirmé que l'incubation des particules virales sur le tissu enduit seul était responsable de la désactivation virale, comme l'ont également récemment démontré Rubino et al.30. L'effet d'inactivation peut être attribué aux propriétés cristallines des sels plutôt qu'au type de sel utilisé, car d'autres sels, notamment le chlorure de potassium (KCl), le sulfate de potassium (K2SO4)30 et le dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4)37, se sont avérés produire un effet similaire lorsqu'ils sont enduits sur des masques chirurgicaux.

En plus de la perturbation mécanique de la capside due à la dissolution/recristallisation du sel, il a été suggéré qu'un stress osmotique accru pendant la recristallisation du sel entraîne la déformation et l'endommagement de la capside virale, entraînant une désactivation20,30,38.

Étant donné que la solution saline contenait 1 % de Tween-20, nous avons cherché à savoir si ce surfactant pouvait également avoir joué un rôle dans la désactivation virale. Le Tween-20 est un tensioactif doux qui peut rompre les interactions lipides-protéines et solubiliser les membranes39, et par conséquent, peut affecter la capside du virus de la grippe A, qui est un assemblage de protéines intégrées dans une membrane lipidique40. Dans la présente étude, trois concentrations de pulvérisation basées sur la taille des coups, qui ont également été utilisées dans la méthode de revêtement au sel, c'est-à-dire les coups 3, 5 et 10, ont été testées. Seule la concentration la plus élevée de Tween-20, dans le traitement Tween Str10, a nettement affecté la réplication virale dans les cellules MUCILAIR avec une réduction log10 de 3,57. Cela montre que le Tween-20 peut également avoir contribué à la désactivation virale dans les échantillons présentant les concentrations de sel les plus élevées. Conformément à cela, il a été rapporté que le Tween-20 réduisait la survie du virus de l'herpès à une concentration de 1 %41 ou 0,25 %42.

Indépendamment de ces considérations techniques, les résultats de la présente étude confirment que le sel peut former une barrière antivirale protectrice non seulement sur les masques chirurgicaux, mais également sur les matériaux ménagers qui pourraient être utilisés dans les masques en tissu lavables. Étant donné que l'effet antiviral du sel a été engendré par la perturbation physique de la capside virale, il est raisonnable de supposer que d'autres virus enveloppés, tels que le SRAS-CoV-2, pourraient être affectés aussi efficacement même s'ils ne sont pas étroitement liés à A/H3N2. Cette activité antivirale spécifique croisée liée à l'altération de la capside a été rapportée pour le SARS-CoV-2 (ARN simple brin sens positif) et le bactériophage phi6 (ADN double brin) après contact avec du tissu non tissé spunlace enduit d'extrait de canneberge26. Le modèle actuel avec la grippe A/H3N2 et l'épithélium nasal humain MUCILAIR peut être mis en œuvre dans un large éventail d'institutions car il ne nécessite que le niveau de biosécurité deux (BSL-2), tandis que l'utilisation du SARS-CoV-2 nécessiterait BSL-3. Ce modèle qui utilise des épithéliums nasaux humains pourrait être étendu à l'évaluation d'autres revêtements antiviraux et pour divers types d'équipements de protection individuelle, en gardant à l'esprit que les interactions entre le virus et le revêtement antiviral pourraient être trop simplifiées et que les résultats positifs devraient être confirmés avec un système plus sophistiqué impliquant des particules virales en aérosol.

Pour le revêtement des masques faciaux en tissu réutilisables, les deux méthodes de dépôt de sel utilisées dans cette étude peuvent être adaptées à un usage domestique pour renouveler la couche protectrice de sel sur le masque après le lavage. Une attention particulière doit être portée à l'utilisation d'une solution saline suffisamment concentrée pour atteindre le seuil d'activité antivirale, tout en évitant les charges excessives de sel qui rendent le masque plus rigide et moins confortable, comme observé pour les revêtements Spr S10 et Dip No Dil. Cependant, la respirabilité et les propriétés de filtration des particules qui sont des paramètres importants pour le choix du matériau pour fabriquer des masques faciaux réutilisables10 ne seraient probablement guère affectées par le revêtement de sel dans la gamme des quantités de sel utilisées dans la présente étude, et comme démontré précédemment avec des membranes en polypropylène à gros pores recouvertes de concentrations proches de NaCl, KCl ou K2SO431. Des tensioactifs faciles à acheter, comme le savon pour les mains, pourraient remplacer efficacement le Tween43. Les solutions de brouillard salin prêtes à l'emploi peuvent devenir une option pratique pour obtenir un revêtement de sel optimal avec une taille et une distribution adéquates des cristaux de sel. Un dispositif de solution de brouillard salin à 10 % a récemment été testé avec succès35.

Le matériau de test était un chiffon en microfibre non tissé universel composé de 80 % de polyester et de 20 % de nylon (JEMAKO Pro Cloth Plus, Jemako, Rhede, Allemagne). Ce matériau, largement disponible dans les magasins de détail, présente de bonnes propriétés de filtration des particules et de respirabilité9,10,44.

La solution saline était composée de 29,03 % p/v (29,03 g/100 ml) de NaCl (Merck, Darmstadt, Allemagne) dans de l'eau déionisée avec 1,0 % v/v (1 ml/100 ml) de Tween-20 (Merck), comme indiqué par Quan et al.20. La solution saline a été testée sous forme non diluée et diluée (dilution 5 ou 10 dans de l'eau déminéralisée). Le Tween-20, un tensioactif non ionique, a été ajouté à la solution saline pour mouiller correctement les fibres de polyester hydrophobes20. Pour évaluer l'effet du Tween-20, une solution à 1,0 % v/v (1 ml/100 ml) de Tween-20 dans de l'eau déminéralisée a été préparée.

Nous avons utilisé deux procédures de revêtement automatisées : pulvérisation et trempage. Le dépôt de revêtement par pulvérisation a été réalisé à l'aide d'une mini valve de pulvérisation (EFD 781 ; Nordson, Westlake, OH, États-Unis) montée sur un robot automatisé (JR2304 ; Janome, Tokyo, Japon). Ce système permettait de contrôler la quantité totale de sel déposée en ajustant des paramètres, notamment la vitesse de dépôt (réglée à 40 mm/s), la distance entre la tête de pulvérisation et le substrat (réglée à 40 mm) et la pression appliquée sur la cartouche contenant la solution saline (réglée à 0,4 bar). Le motif de dépôt consistait en lignes droites parallèles distantes de 4 mm. La course (ouverture de la valve contrôlant le débit) a été modifiée avec les unités de course arbitraires 1, 3, 5 et 10, étiquetées Spr S1, Spr S3, Spr S5 et Spr S10, respectivement. Pour évaluer l'effet de la dilution à volume constant, un échantillon supplémentaire avec l'unité de course 3 a été préparé avec une solution de revêtement diluée cinq fois (Spr S3 Dil5 ×). Un morceau de matériau d'essai par condition de taille 6,5 cm × 6,5 cm a été traité.

Le revêtement par trempage a été réalisé à l'aide d'une coucheuse par trempage automatisée (KSV Nima (taille moyenne); Biolin Scientific, Espoo, Finlande). Trois morceaux de matériau d'essai par condition, de taille 2,5 × 3 cm, ont été préparés. Le revêtement par trempage a été réalisé en utilisant trois concentrations de sel : non dilué, dilué 5 × et dilué 10 × (marqués Dip No Dil, Dip Dil5 × et Dip Dil10 × , respectivement). Les morceaux de tissu ont été complètement immergés dans la solution pendant 3 s et retirés à une vitesse constante de 100 mm/min. Les morceaux ont été suspendus verticalement et laissés s'égoutter pendant 30 min.

Pour évaluer l'effet antiviral potentiel du Tween-20, une solution à 1 % de Tween-20/eau a été pulvérisée sur le matériau d'essai en utilisant le dispositif de pulvérisation et les conditions ci-dessus. Les coups de pulvérisation 3, 5 et 10 ont été appliqués, étiquetés Tween Str3, Tween Str5 et Tween Str10, respectivement. Les échantillons ont été séchés, stockés et manipulés de la même manière que les échantillons recouverts de sel.

Après revêtement, le matériau a été séché à température ambiante (20 ° C) pendant une nuit et stocké dans des sacs en plastique propres et scellés sous une atmosphère d'azote. Pour tous les échantillons recouverts de sel, le sel déposé a été quantifié en pesant l'échantillon avant revêtement et après séchage. Pour déterminer la taille et la distribution des cristaux de sel sur les matériaux, les échantillons revêtus ont été analysés par SEM et EDX. Les protocoles sont décrits dans les informations supplémentaires.

Les modèles de cellules respiratoires humaines MUCILAIR-HF (Epithelix, Genève, Suisse) sont des épithéliums respiratoires 3D entièrement matures et fonctionnels co-cultivés avec des fibroblastes. Les épithéliums MUCILAIR (numéro de lot HF-MP0009) ont été reconstitués avec des cellules épithéliales nasales isolées de 14 donneurs subissant une polyplectomie nasale chirurgicale (âge, 24-58 ans, médiane, 53 ans) et co-cultivées avec des fibroblastes humains sur des inserts TRANSWELL (Corning, Glendale, AZ, USA)32. Toutes les procédures expérimentales pour obtenir les échantillons de cellules ont été expliquées en détail et tous les sujets ont fourni un consentement éclairé écrit. L'étude a été menée conformément à la déclaration d'Helsinki sur la recherche biomédicale (amendement de Hong Kong, 1989), et le protocole de recherche a été approuvé par la commission d'éthique locale. Des cultures matures (âgées de 66 jours) ont été utilisées dans les expériences antivirales. La qualité des cultures cellulaires a été contrôlée avant utilisation, comme décrit dans les informations supplémentaires.

Les particules du virus A/H3N2 ont été initialement isolées directement sur l'épithélium MUCILAIR à partir d'un échantillon clinique33, et la lignée, A/Switzerland/8004462/2013(H3N2), a été identifiée par PCR, un test d'inhibition de l'hémagglutination et un séquençage partiel du gène de la neuraminidase. Des stocks de cet isolat ont été produits dans des cultures MUCILAIR en recueillant des lavages apicaux avec du milieu de culture et utilisés avec succès dans des expériences d'infection32,33. La procédure de production complète est décrite dans les informations supplémentaires.

Immédiatement avant l'exposition au virus, le matériau enrobé a été retiré des sacs à température ambiante (26 % d'humidité relative), coupé en morceaux de 1 cm2 à l'aide de ciseaux et placé dans des boîtes de Pétri stériles. Toutes les opérations ont été effectuées dans un environnement propre et sec. De plus, des morceaux de 1 cm2 du matériau non revêtu ont été préparés pour servir d'échantillons de contrôle. Les deux côtés des morceaux de tissu ont été stérilisés par rayonnement ultraviolet-C pendant 30 min, en utilisant une lampe UV900 G30T8 (à 12,0 W pendant 100 h ; Philips Lighting, Lamotte-Beuvron, France).

Avant l'inoculation virale, les inserts épithéliaux MUCILAIR ont été placés dans des plaques à 24 puits contenant 500 µL/puits de milieu de culture MUCILAIR et lavés avec 200 µL de milieu de culture MUCILAIR à 34 °C pendant 10 min. Trois morceaux de matériau d'essai par condition de revêtement et cinq morceaux de matériau non revêtu, d'une taille de 1 cm2 chacun, ont été placés dans des puits séparés d'une plaque à 24 puits (CORNING COSTAR 3526 ; Corning, NY, USA). A partir du stock de virus, une solution contenant 2 × 108 copies du génome a été préparée dans du milieu de culture MUCILAIR. Cinq microlitres de la préparation A/H3N2 (106 gc) ont été déposés sur chaque morceau du matériau d'essai. Après 10 min d'exposition directe, 1 mL de milieu MUCILAIR a été ajouté dans chaque puits contenant un échantillon à tester pour recueillir le virus. Après 5 min d'incubation à température ambiante, suivie d'un mélange par mouvements de pipetage, le milieu contenant les particules virales a été transféré dans une nouvelle plaque 24 puits et dilué au 1/10 dans du milieu MUCILAIR. Ensuite, 100 µL de la solution ont été appliqués apicalement sur des cellules cultivées sur des inserts MUCILAIR pour infection à 34 °C, 5 % de CO2 et 100 % d'humidité relative pendant 3 h. L'inoculum de virus a ensuite été jeté et les cellules ont été lavées trois fois avec 200 µL de milieu MUCILAIR. À 3,5, 24, 72 et 144 h après l'inoculation virale, 200 μL de milieu MUCILAIR ont été ajoutés aux cellules, qui ont ensuite été incubées pendant 20 min (34 ° C, 5 % de CO2 et 100 % d'humidité relative). Les lavages apicaux ont été collectés et stockés à -80 ° C jusqu'à la quantification des copies du génome ou des titrages viraux. Des échantillons non revêtus (Non coated) et des cultures directement infectées (Control no-mask) ont été inclus comme témoins. L'intégrité épithéliale au cours de l'expérience a été surveillée en mesurant le TEER. Les cultures MUCILAIR non traitées et non infectées (Mock) et les cultures traitées avec le détergent Triton X-100 ont servi de contrôle négatif et positif supplémentaire pour la mesure de la TEER. Le milieu sous les puits des inserts MUCILAIR a été changé une fois 48 hpi avec 500 µL de milieu de culture MUCILAIR frais.

Des solutions salines à des concentrations de 0,9 %, 3,5 % et 35 % ont été préparées dans de l'eau déminéralisée. Une solution de virus A/H3N2 (5 µL) contenant 106 copies de génome a été diluée 1:1 avec du milieu de culture MUCILAIR (Control Medium) ou avec les différentes solutions salines et incubée à température ambiante pendant 10 min. Le milieu témoin et les solutions salines contenant le virus ont été dilués au 1:10 dans du milieu de culture MUCILAIR et 100 µL des dilutions ont été inoculés apicalement sur des inserts MUCILAIR (n = 3) pour une infection pendant 3 h. Les virus ont été collectés et quantifiés à 3,5, 24, 72 et 144 h après l'infection. L'intégrité épithéliale au cours de l'expérience a été surveillée en mesurant le TEER.

L'intégrité de l'épithélium MUCILAIR a été évaluée à 24, 72 et 144 h après l'infection en mesurant TEER32,33 (voltmètre-ohmmètre EVOMX, World Precision Instruments, Stevenage, Royaume-Uni).

La réplication virale a été évaluée à 3, 5, 24, 72 et 144 h après l'infection par la quantification des copies du génome à l'aide de la sonde RT-qPCR TAQMAN (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les deux méthodes sont décrites dans les informations supplémentaires.

Nous avons utilisé des cellules MDCK-SIAT1 pour le titrage viral (Merck). Cette lignée cellulaire a été établie à partir de la transfection stable de cellules MDCK avec de l'ADNc codant pour l'α-2,6-sialyltransférase humaine (SIAT1) pour surexprimer les acides sialiques liés en 645. Les cellules ont été cultivées dans un milieu de croissance constitué du milieu Eagle modifié de Dulbecco avec GlutaMAX (31 966 021 ; Life Technologies, ThermoFisher Scientific) additionné de 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal (2-01F16-I ; BioConcept Ltd, Allschwil/Basel, Suisse), 1 % d'acides aminés non essentiels (10 938 025 ; Life Technologies, ThermoFisher Scientific) et 1 % pénicilline–streptomycine (15,140,122 ; Life Technologies, ThermoFisher Scientific). Le milieu d'infection sans sérum était de la pénicilline-streptomycine à 1 % dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco, et le milieu de dosage était un milieu sans sérum additionné de 1 µg/mL de trypsine (T1426 ; Merck). Les cultures ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2. Les monocouches confluentes ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate et un milieu sans sérum a été ajouté. Les cellules ont été inoculées en quadruple avec des dilutions en série de dix fois d'une solution virale et ont été incubées à 37 ° C pendant 1 h pour l'infection. Ensuite, l'inoculum a été aspiré, le milieu de dosage a été ajouté et les cellules ont été incubées à 37°C. Quatre jours après l'infection, la présence d'un effet cytopathique, visible comme le détachement des cellules mortes de la monocouche, a été observée et quantifiée au microscope optique. Des lavages apicaux d'épithéliums nasaux MUCILAIR infectés par A / H3N2 collectés 72 h après l'infection ont été utilisés pour le titrage du virus et la quantification des copies du génome pour les conditions de test suivantes: Spr S1, Spr S3, Spr S10, Dip Dil10 × , Contrôle sans masque, Non enduit et Tween Str3. Les titres viraux ont été déterminés par la méthode du point final de Reed et Muench46 et exprimés en log10 TCID50/mL.

Le nombre de copies du génome et les titres viraux sont distribués de façon log-normale47,48,49. Quelques comparaisons scientifiquement sensées ont été prévues dans la conception de l'étude : les nombres de copies du génome basés sur log10 et les titres viraux dans le contrôle non enrobé ont été comparés aux traitements enrobés de sel et de Tween par le test t de Student à deux échantillons avec modification de Welch aux degrés de liberté (fonction R t-test unilatérale)50. L'hypothèse nulle était que les vraies moyennes dans les échantillons non enrobés et avec les traitements enduits de sel et de Tween étaient égales, et l'hypothèse alternative était que les vraies moyennes dans les échantillons avec des traitements enrobés étaient plus petites que celles des témoins non enrobés. Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme significatives et ont conduit au rejet de l'hypothèse nulle.

Les ensembles de données générés et analysés dans la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy pour l'édition d'un brouillon de ce manuscrit. Des recherches sur les matériaux et le revêtement des masques ont été menées à l'aide de Taxila, une plate-forme d'exploration de connaissances et d'analyse de texte développée par SBX Corporation, Tokyo, Japon.

Ce travail a reçu le financement et le soutien de Philip Morris International, Epithelix Sàrl et du Centre Suisse d'Electronique et de Microtechnique (CSEM) SA. Le projet, sous le nom de consortium ProMask.CH, a été cofinancé par le canton de Berne, en Suisse, à partir des prêts d'urgence Corona destinés à soutenir l'économie locale pendant la crise du COVID-19.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Sandra Schorderet Weber, Xavier Bulliard et Rosy Bonfante.

PMI R&D, Philip Morris Products SA, Quai Jeanrenaud 5, 2000, Neuchâtel, Suisse

Sandra Schorderet Weber, Yang Xiang, Sandro Steiner, Alexandra Laurent, Shoaib Majeed, Stefan Lebrun, Arkadiusz Kuczaj, Manuel C. Peitsch, Julia Hoeng & Adrian Stan

Centre Suisse d’Electronique et de Microtechnique SA (CSEM), Rue Jaquet-Droz 1, 2002, Neuchâtel, Switzerland

Xavier Bulliard, Silvia Biselli, Raphaël Pugin & Michele Palmieri

Epithelix Sàrl, Chemin des Aulx 18, 1228, Plan-les-Ouates, Geneva, Switzerland

Rosy Bonfante et Samuel Constant

Coat-X SA, Eplatures-Grise 17, 2300, La Chaux-de-Fonds, Switzerland

Andreas Hogg

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L'étude a été conçue par SC, JH, RP et XB Les travaux de laboratoire et la collecte de données ont été effectués par RB, SC, XB, SB, AL et SM L'analyse et l'interprétation des données ont été effectuées par SC, SSW et AS et les statistiques gérées par YX La logistique de l'étude a été prise en charge par SS, AL, SM, XB et SL La première ébauche du manuscrit a été rédigée par SSWAS, SS, JH et AK ont commenté les versions préliminaires. JH, MCP, MP, AS et AH ont soutenu et financé le travail. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Sandra Schorderet Weber.

Les auteurs SSW, YX, SS, AL, SM, SL, AK, MCP, JH et AS sont des employés de Philip Morris International. Les auteurs SC et RB sont des salariés d'Epithelix Sàrl, et les auteurs XB, SB, RP et MP sont des salariés du CSEM SA. L'auteur AH est un employé de Coat-X SA.

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Réimpressions et autorisations

Schorderet Weber, S., Bulliard, X., Bonfante, R. et al. Test in vitro du revêtement de sel des tissus en tant qu'agent antiviral potentiel dans les masques faciaux réutilisables. Sci Rep 12, 17041 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21442-7

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Reçu : 11 avril 2022

Accepté : 27 septembre 2022

Publié: 11 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-21442-7

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